中文品名：阿狄科®嗜酸性粒细胞衍生神经毒素检测试剂盒（酶联免疫法）

英文品名：IDK® EDN ELISA

通用名称： 嗜酸性粒细胞来源神经毒素检测试剂盒（酶联免疫法）

简称: EDN ELISA

货号： K 6811

方法学： ELISA

规格： 96 人份/盒

产地：德国

试剂盒内包含校准品浓度范围： 0.25 - 16 ng/ml

可用样本类型及用量：

孵育时间：

· 孵育1小时

· 孵育1小时

· 孵育10-20分钟

使用说明书： 随试剂盒提供

注册状态： CE 认证

EDN（嗜酸性粒细胞衍生神经毒素，嗜酸性粒细胞蛋白X，EPX）是一种阳离子糖蛋白，由活化的嗜酸性粒细胞释放，具有很强的细胞毒性，在预防病毒感染中发挥重要作用。它在嗜酸性粒细胞主要存在的部位——皮肤、肺部、泌尿生殖道和胃肠道——由嗜酸性粒细胞颗粒释放，这些器官是病原体入侵的入口。肠道内EDN的积累与组织损伤有关。

测定粪便中的EDN可以作为当前胃肠道区域临床或亚临床慢性炎症的客观参数。对于溃疡性结肠炎和克罗恩病，EDN测量有助于评估疾病活动和预测复发。

同时也提供单点校准嗜酸性粒细胞衍生神经毒素检测试剂盒检测试剂盒（货号 K 6821）。

预期用途

阿狄科®嗜酸性粒细胞衍生神经毒素检测试剂盒（酶联免疫法）是一种酶联免疫分析测定，用于定量检测血清、血浆、尿液和粪便中的EDN（嗜酸性粒细胞衍生神经毒素，也称为RNASE2或嗜酸性粒细胞蛋白X [EPX]）。

仅用于体外诊断。在中国境内当前仅用于科研。

适应症

· 克罗恩病

· 食物过敏与不耐受的证明

· 排除饮食疗法的评估

· 肠粘膜完整性受损的证明（如慢性炎症性肠病、结肠癌）

· 肠道寄生虫/寄生虫病的证明

检测原理

· 本检测采用双抗体夹心 ELISA 法。两种选定的抗体（单克隆和多克隆）可与人 EDN 结合。

· 将含有 EDN 的检测校准品、质控品和已稀释的病人样本加入预先包被了高亲和力抗人 EDN 单克隆抗体的微孔板孔中。第一次孵育后，固定在微孔板壁上的抗体捕获样本中的人 EDN。然后，向每孔加入辣根过氧化物酶标记的兔多克隆抗人 EDN 抗体，形成捕获抗体-人 EDN-酶标抗体的夹心复合物。以四甲基联苯胺（TMB）作为过氧化物酶的底物。最后，加入酸性终止液终止反应，颜色由蓝色变为黄色。黄色的强度与 EDN 浓度成正比。使用校准品的测定值，绘制吸光度（450 nm 处的光密度 OD 值）相对于浓度的剂量-反应曲线。患者样本中的 EDN 浓度可直接从该曲线计算得出。

3. 试剂盒组成

试剂储存与配制

· 多次检测说明：若试剂盒需多次使用，请按标签所示条件储存试剂。每次检测仅配制所需量。试剂盒在标签所示有效期内最多可使用4次。

· 小体积试剂处理：体积小于 100 µl 的试剂在使用前应进行离心，以避免体积损失。

· 工作洗液配制：

o 使用前，用超纯水将浓缩洗液（WASHBUF）按 1:10 稀释（例如：100 ml WASHBUF + 900 ml 超纯水），混匀。

o 浓缩液中盐浓度较高，可能出现结晶。稀释前，须在室温或 37 °C 水浴中将结晶重新溶解。

o 浓缩液在 2–8 °C 下可稳定保存至标签所示有效期。

o 已稀释的工作洗液（1:10 稀释的 WASHBUF）可在密闭容器中于 2–8 °C 储存 1 个月。

· 提取液配制：

o 使用前，用超纯水将 IDK Extract® 提取液浓缩液按 1:2.5 稀释（例如：100 ml IDK Extract® + 150 ml 超纯水），混匀。

o 浓缩液中盐浓度较高，可能出现结晶。稀释前，须在 37 °C 水浴中将结晶重新溶解。

o 浓缩液在 2–8 °C 下可稳定保存至标签所示有效期。

o 已稀释的提取液（1:2.5 稀释的 IDK Extract®）可在密闭容器中于 2–8 °C 储存 4 个月。

· 校准品/质控品：

o 冻干的校准品（STD）和质控品（CTRL）在 2–8 °C 可稳定保存至标签所示有效期。

o 使用前，用 500 µl 超纯水复溶 STD 和 CTRL，并轻轻颠倒混匀以确保完全复溶。静置 10 分钟使其溶解，然后充分混匀。

o 已复溶的校准品和质控品可在 2–8 °C 储存 4 周。

· 酶结合物配制：

o 使用前，用洗涤液将酶结合物浓缩液（CONJ）按 1:101 稀释（例如：100 µl CONJ + 10 ml 洗涤液）。

o 浓缩液在 2–8 °C 可稳定保存至标签所示有效期。

o 注意：已稀释的酶结合物不稳定，不可储存，需现用现配。

· 其它试剂：所有其他检测试剂均为即用型。在 2–8 °C 储存时，可稳定保存至标签所示有效期。

样本的储存与处理

样本储存

· 粪便（原始样本）：

o 室温（15-30 °C）和 4 °C 可储存 72 小时。

o -20 °C 可储存 8 周。

· 粪便提取物（1:100 稀释）：

o 室温（15–30 °C）可储存 1 天。

o 2–8 °C 可储存 5 天。

o -20 °C 可储存 7 天。

o 避免超过两次冻融。

粪便样本提取

IDK Extract® 稀释液（1:2.5 稀释的提取液）用作样本提取缓冲液。推荐使用以下样本制备步骤（采用粪便样本应用系统 [SAS]，货号：K 6998SAS）：

粪便样本管 – 使用说明

请注意，最终粪便悬浮液的稀释倍数取决于所用粪便样本量和缓冲液体积。

示例（SAS 法，使用 1.5 ml 提取液）：

· 粪便用量：15 mg

· 缓冲液体积：1.5 ml

· 稀释倍数：1:100

请按以下步骤使用 SAS 制备粪便样本：

a) 样本前处理：冻存的原始粪便样本需解冻。对于异质性较强的样本，推荐使用涂抹器、接种环等器械进行机械匀浆。

b) 加缓冲液：在放入样本前，向空的样本管中加入 1.5 ml 提取液（1:2.5 稀释的 IDK Extract®）。重要提示：提取液需恢复至室温。

c) 取样：旋开管盖（黄色部分）。将黄色采样棒插入样本中，确保采样棒下部的凹槽完全被粪便覆盖。然后将采样棒放回管中。当采样棒被重新放回管内时，多余的样本会被刮除，留下 15 mg 样本用于稀释。拧紧管盖。

d) 涡旋混匀：用力涡旋样本管，直至采样棒凹槽内无残留粪便。重要提示：请确保涡旋后得到均匀的悬浮液。对于较硬的样本，在缓冲液中浸泡约 10 分钟可改善结果。

e) 静置沉降：让样本静置约 10 分钟，使沉淀物沉降。漂浮物（如谷物外壳等）可忽略不计。

f) 移除采样棒：小心旋开整个管盖（包括蓝色圆环和采样棒），弃去。确保不搅动已沉降的沉淀物。

至此得到第一次稀释液（稀释 I：1:100）。

样本的稀释

· 粪便样本：

o 将提取后的上清液（稀释 I）用工作洗液再稀释 4 倍。

o 例如：100 µl 稀释 I + 300 µl 工作洗液 = 稀释 II （1:4）

o 最终稀释倍数：1:400*。

o *注意：对于预期浓度较高的样本，推荐使用 1:1000 的稀释度。

o 检测时，每孔加入 100 µl 稀释 II。

· 尿液样本：

o 推荐分析 24 小时尿液，此时 EDN 浓度以 mg/天表示。若无 24 小时尿液，也可分析单次尿液样本，此时应同时测定尿肌酐，结果以 µg/mmol 肌酐表示。

o 收集尿液 30 分钟内，在 4 °C、1350 g 条件下离心两次，每次 10 分钟。将上清液转移至新的塑料管中。

o 分析前，用检测缓冲液（ASYBUF）将尿液样本稀释 400 倍。

o 例如：10 µl 样本 + 190 µl ASYBUF = 稀释 I （1:20）

15 µl 稀释 I + 285 µl ASYBUF = 稀释 II （1:20）

o 最终稀释倍数：1:400

o 检测时，每孔加入 100 µl 稀释 II。

· 血清/血浆样本：

o 新鲜采集的血清/血浆应在 1 小时内离心。若非当日检测，样本应储存于 -20 °C。脂血或溶血样本可能导致结果不准确。检测前应将样本充分混匀。建议每个样本进行复孔检测。

o 分析前，用检测缓冲液（ASYBUF）将血清/血浆样本稀释 40 倍。

o 例如：10 µl 样本 + 390 µl ASYBUF

o 最终稀释倍数：1:40

o 检测时，每孔加入 100 µl 稀释液。

检测步骤

检测前，将所有试剂和样本恢复至室温（15–30 °C）并充分混匀。

在实验记录单上标记好校准品/样本/质控品的位置。

从试剂盒中取出所需数量的微孔条。未使用的微孔条与干燥剂袋一起放回密闭的铝箔袋中，于 2–8 °C 储存。在标签所示有效期内稳定。

对于全自动 ELISA 处理仪，可能需要根据具体平台的特点调整给定的操作程序。详情请咨询供应商或 Immundiagnostik AG。

建议每个样本进行复孔检测。

1. 洗板：使用前，用工作洗液250 µl洗板 5 次。最后一次洗涤后，在吸水纸上用力拍打板子以去除残留液体。

2. 加样：分别向相应孔中加入校准品/质控品/稀释好的样本各100 µl。

3. 第一次孵育：盖上覆膜，在室温（15–30 °C）下，于水平振荡器*上以 550 rpm、2 mm 振幅振荡孵育 1 小时。

4. 洗板：弃去孔内液体，用工作洗液250 µl洗板 5 次。最后一次洗涤后，在吸水纸上用力拍打板子以去除残留液体。

5. 加酶结合物：向每孔加入已稀释的酶结合物（CONJ）100 µl。

6. 第二次孵育：盖上覆膜，在室温（15–30 °C）下，于水平振荡器*上以 550 rpm、2 mm 振幅振荡孵育 1 小时。

7. 洗板：弃去孔内液体，用工作洗液250 µl洗板 5 次。最后一次洗涤后，在吸水纸上用力拍打板子以去除残留液体。

8. 加底物：向每孔加入 底物液（SUB）100 µl。

9. 显色孵育：在室温（15–30 °C）下避光孵育 10–20 分钟**。

10. 终止反应：向每孔加入终止液（STOP）100 µl，充分混匀。

11. 读数：立即用酶标仪在 450 nm 波长（参考波长620 nm（或 690 nm））测定吸光度。若无参考波长，则仅在 450 nm 读数。若最高校准品的吸光度超出光度计范围，则必须立即在 405 nm 波长（参考波长620 nm）下测定吸光度。

*注意：推荐在水平振荡器上以 550 rpm 转速、2 mm 振幅振荡孵育。

**注意：颜色变化强度对温度敏感。建议观察颜色变化，并在颜色分化良好时终止反应。