本产品用于定性分析人体活检切片组织中C4d在肾小管周毛细血管的沉积

Anti C4d(BI-RC4D)
规格： 250μl/每瓶
形式： 液体IgG 片段，蛋白G 层析法纯化
应用： 人组织石蜡和冰冻 切片

Anti C4d, FITC 

规格：100μl/每瓶
形式: 液体IgG 片段，蛋白G 层析法纯化
应用： 流式细胞术
 
产品优势
C4d多克隆抗体
可同时作用于石蜡切片和冰冻切片上

临床检测意义
 
C4d 在肾小管周毛细血管的沉积可作为诊断抗体介导排斥反应的重要依据，是抗体介导的移植肾损伤的标志，与移植肾的预后相关，是肾失功独立预测因素。

受者人体循环中同种抗体和移植的内皮细胞结合是首要目标。活的内皮细胞可以通过帽化，脱落与 内化快速消除来自细胞表层的结合抗体。

C4d 是补体因子C4激活后的裂解片段，是经典补体级联反应的成分，通过抗体与特异性的目标分子 结合而启动。C4d检测被看做是抗体排斥同种移植反应的间接印证或者印记。在大多的文献中都将 C4d看做是肾脏，心脏， 肝脏以及其他移植中的重要的指标。

移植肾中急性抗体介导排斥的鉴定
1. 肾小球 C4d 沉积可先于局灶节段性肾小球硬化的发展 van de Lest et al., Kidney Int, 2019; 96(3):738-749.
2. “肾小球 C4d 沉积可先于 FSGS 的发展，这表明补体激活可能在 FSGS 的发展中发挥致病作用。” C4d 在肾移植受者活检组织中的重要性。 Corrêa, Clin Develop Immun, 2013; 2013:678180.
3. “对活检标本中 C4d 染色呈阳性的 AMR 进行进一步研究，以及对可能参 与这一过程发病机制的新型常规标志物的研究都非常重要。” 患有急性 T 细胞介导的排斥反应的肾移植受者对治疗的反应和长期结果 Bouatou et al., Am J Transplant, 2019; 19(7):1972-1988. “因此，对急性 TCMR 治疗反应的临床、组织学和免疫学评估揭示了对治疗 反应的不同特征，具有不同的结果。”


采样及送检方式
医生从患者体内切取，钳取或穿刺取出病变组织，制作成石蜡或冰冻切片


工作步骤
抗C4d 抗体，石蜡切片（4.5%中性缓冲液福尔马林固定），免疫组化法
1 .切片脱蜡及水化
2 .抗原修复，在125℃TRIS/EDTA修复液(PH8.5) 中高压5min,冷却20min至室温。 TRIS/EDTA缓冲液：10ml 1M TRIS(ph9)+20ml 0.05M EDTA(ph7.5)+970ml H₂Obidest
3.PBS 冲洗
4 .PBS 配制3% H₂O₂ 对内源性过氧化物酶进行封闭 10min
5. PBS 冲洗
6 .滴加UltraVsion Block 孵育5min
7 .PBS 冲洗
8. 滴加抗C4d抗体，用PBS-BSA(1%BSA)1：30-1：50稀释，室温下孵育60min
9. PBS 冲洗
10. 滴加Primary Antibody Enhancer， 在室温下孵育20min
11. PBS 冲洗
12.滴加HRP Polymer(酶标二抗)，在室温下孵育30min
13. PBS 冲洗
14. DAB 或AEC 显色剂显色（根据染色深浅调整时间）
15. 水龙头水冲洗10min
16. Mayer 苏木精复染 1min
17. 水溶性封片剂封片
 
抗C4d抗体， 冰冻切片， 间接免疫荧光法
1. 冰冻切片在用PBS 1:20-1:30 稀释兔抗C4d多克隆抗体液中室温下孵育 30min，
2.PBS 冲洗4次
3. 用FITC 标记二抗兔抗C4d抗体（根据供应商提供比例稀释），之后孵育检测结合的抗体
4. PBS 冲洗4次
5. 水溶性封片剂封片
 
Frequently asked questions 常见问题

1. 对于C4d多克隆抗体，应当使用什么作为阳性控制？

最好的阳性控制是有抗体介导排斥反应的病例。证明抗体介导排斥反应最理想的就是来自同一样品的冰冻切片上的阳性C4染色。或者是有抗体介导排斥反应典型临床表现且被Luminex技术证明或传统交叉配型测试过的供者特异性抗体病例也可以
如果没有明确的体液排斥反应可以作为阳性控制，你可以使用膜性肾小球肾炎（自体肾或者TX）切片, C4d将会沿着肾小球基底膜（GBM Fig 1A）产生一个颗粒状的染色模式，几乎同由IgG(Fig 1B)产生的染色模式一样. 有必要多测试几个病例因为补体成分经典途径产生的沉积物在MGN(膜性肾小球肾炎)中是易变的。

2. C4d诊断相关的染色模式是什么？
  抗体介导排斥反应唯一的诊断相关的染色模式是沿着管周毛细血管（PTH Fig2A）的线性C4d沉积物.在最近的一项调查中发现在管周毛细血管中不连续的粗糙颗粒状的典型的病灶染色模式与抗体介导排斥反应没有关联性。

3. C4d 沉积物在其他位置有什么意义？
  C4d沉积物在肾脏的不同腔室都可以发现。总的来说非管周毛细血管对抗体介导排斥反应没有诊断的相关性（除了肾小球内皮细胞染色 Fig 3A）. 在动脉和小动脉壁上（Fig 2C, 箭头跟三角形）很常见的可看到多变数量的C4d。例如在免疫复合物介导的肾小球肾炎匹配的其他补体（Fig 2D，箭头和三角形）的分配与模式这样许多的例子中可以找到肾小球C4d沉积物。此外在慢性移植肾小球病中也会发现肾小球C4d 沉积物。肾小球病中的C4d染色很明显的会影响大部分甚至整个毛细血管壁（对比在一些抗体介导排斥反应病例中发现的官腔型内皮细胞染色模式）。肾小球病中的肾小球毛细血管壁染色模式经常会联想到在有内皮沉积物的免疫复合物介导的肾小球肾炎中观察到的染色模式。在很多病例中，其他补体成分的免疫组化和免疫球蛋白需要作出可靠的有差别的诊断。
 
4. C4d 多克隆抗体是否适用在免疫荧光法的冰冻切片上？
  是，C4d 多克隆抗体可以用在冰冻切片上，且染色结果等同于单克隆抗C4d抗体中观察到的模式，但单克隆抗C4d抗体不适用与石蜡切片。

5. 理想的染色步骤是什么？

每个实验室本身可以判断何为理想的染色步骤。合理的是要从供应商提供的C4d抗体开始染色步骤。热诱导抗原修复在大多实验室中都是必须的。一些公司会发现高压修复要优于微波修复。因为后者会造成敏感性降低。但是这和其他染色细节仍然需要测试和根据实验室情况去调节。

6. 石蜡切片免疫组化的敏感度等同于冰冻切片免疫发光的敏感度吗？
通过一些专门解决这个问题的研究得出结论：冰冻切片免疫荧光法总的来说比石蜡切片免疫组化的敏感度高。考虑这个情况，Banff 分类
 

7. 如果不能对切片采取高压处理，是否有其他的方法处理切片？
其他的方法就是用微波修复抗原，由于我们对此种方法没有验证过，客户可以尝试不同抗体稀释方法来验证非特异性结合。

8. 工作步骤上面的参考信息是否使用抗体
所引用的参考信息的确使用了那种抗体。请看Link Literature Reference 或咨询客服专员索取信息。

9. IgG的浓度是什么？
0.2mg/ml,纯IgG,通过蛋白质G纯化， 无载体蛋白

10. 工作步骤中所给出的PBS 缓冲液仅仅就只是纯PBS缓冲液吗？是否包含BSA 或者一些蛋白质在里面？
缓冲液只是纯的PBS 溶液 10mM/PBS/140Mm NaCI ph7

11. 抗体是否会和狗发生交叉反应？
总的来说C4d的活性在哺乳类的物种中比较保守。所以有很大的可能性在狗身上也会发现C4d.目前对于跟狗的交叉性反应还不清楚。

12. H₂O₂ 封闭液是使用Superstain 还是其他的？
30% Fluka Hydrogen peroxide ,1:10 甲醛稀释，室温下10min(最终浓度3%)

13. 工作步骤上指出要用20mM的PBS—配方是什么？
20mMPBS 溶液要准备200mM的原液
A: 5.244g NaH2PO4x1H2O+大概190ml aqua bidest, PH=7.4
B:28.83g Na2HPO4x2H2O+大概810ml aqua bidest, PH=7.4
混合A和B,PH控制7.4， 添加到1L工作液中， 在0.9% NaCi中稀释原液1:10

14. 用Harris 苏木精复染会出现问题吗？
用Harris 苏木精复染不会有问题。反应产品稳定， 你需要相应的优化复染时间（使用你常用的石蜡切片）

15. 有没有可能每次冲洗5min?
是，最少要5min的冲洗时间。 你应当更换PBS溶液4次。


参考文献
1. Solid phase detection of C4d-fixing HLA antibodies to predict rejection in high immunological risk kidney transplant recipients.
2. Bartel G et al., Transpl Int, 2013; 26(2): 121-130 Preformed complement-activating low-level donor-specific antibody predicts early antibody-mediated rejection in renal allografts.
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4. Wahrmann M et al., Hum Immunol, 2013; 74(1): 32-40 
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6. Wahrmann M et al., Transplantation, 2010; 89(11): 1385-1390. C4d-fixing capability of low-level donor-specific HLA antibodies is not predictive for early antibody-mediated rejection.
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9. Bartel G et al., Am J Transplant, 2008; 8(1): 41-49 Pivotal role of complement-fixing HLA alloantibodies in presensitized kidney allograft recipients.
10. Wahrmann M et al., Am J Transplant, 2006; 6(5 Pt 1): 1033-1041 [C4d]FlowPRA screening – a specific assay for selective detection of complement-activating anti-HLA alloantibodies.
11. Wahrmann M et al., Hum Immunol 2005; 66(5): 526-534 Capillary deposition of complement split product C4d in renal allografts is associated with basement membrane injury in peritubular and glomerular capillaries: a contribution of humoral immunity to chronic allograft rejection.
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本品仅用于科研。